No hay ninguna prueba que pueda dar un diagnóstico definitivo de ELA, aunque la presencia de señales de deterioro de las neuronas motoras superiores e inferiores en una sola extremidad constituye una fuerte indicación. Más bien, el diagnóstico de ELA está basado primordialmente en los síntomas y señales que el médico observa en el paciente y en una serie de pruebas que descartan otras enfermedades. Los médicos obtienen el historial médico completo y generalmente realizan un examen neurológico a intervalos regulares para evaluar si los síntomas como la debilidad muscular, atrofia muscular, hiperreflexia, y espasticidad se están empeorando progresivamente.

Ya que los síntomas de la ELA pueden ser similares a aquellos de una gran variedad de otras enfermedades o trastornos más fáciles de tratar, hay que realizar los exámenes apropiados para descartar la posibilidad de otras enfermedades. Una de estas pruebas es la electromiografía (EMG), una técnica especial de registro que detecta la actividad eléctrica en los músculos. Algunos de los hallazgos de la EMG pueden apoyar el diagnóstico de ELA. Otra prueba común mide la velocidad de conducción de los nervios (NCV, por sus siglas en inglés). Anormalidades específicas en los resultados de la NCV pueden sugerir, por ejemplo, que el paciente tiene un tipo de neuropatía periférica (daño a los nervios periféricos) o miopatía (enfermedad muscular) en vez de ELA. El médico puede ordenar una resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés), un procedimiento no invasivo que utiliza un campo magnético y ondas de radio para hacer imágenes detalladas del cerebro y de la médula espinal. Aunque a menudo los exámenes de resonancia magnética son normales en pacientes con ELA, es posible que revelen problemas que puedan estar causando los síntomas, como un tumor en la médula espinal, un disco herniado en el cuello, una siringomielia, o espondilosis cervical.

De acuerdo con los síntomas del paciente y los resultados del examen médico y de estas pruebas, el médico puede ordenar exámenes de sangre y orina para eliminar la posibilidad de otras enfermedades así como exámenes de laboratorio de rutina. En algunos casos, por ejemplo, si el médico sospecha que el paciente tiene una miopatía en vez de ELA, es posible que realice una biopsia muscular.

En algunos casos, las enfermedades infecciosas como el virus de inmunodeficiencia humano (VIH), el virus de la leucemia de células T humana (HTLV, por sus siglas en inglés), y la enfermedad de Lyme pueden causar síntomas similares a la ELA. Trastornos neurológicos como la esclerosis múltiple, el síndrome post-polio, la neuropatía motora multifocal, y la atrofia muscular espinal también pueden imitar ciertas facetas de la enfermedad y deben ser consideradas por los médicos que intentan hacer un diagnóstico. Debido al pronóstico que lleva este diagnóstico y la variedad de enfermedades o trastornos que pueden parecerse a la ELA en sus etapas tempranas, es posible que los pacientes deseen una segunda opinión neurológica.